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重測序、轉錄組和甲基化貫穿分析
                                ——基因組印記研究

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目的:
分析雜交種子(F1)胚乳表達譜的親源效應(母源表達或父源表達);
分析雜交種子(F1)胚乳和胚的甲基化差異以及甲基化的親源效應;
分析親源表達效應與甲基化的關系

研究概述和樣本設計

研究概述:
將蓖麻兩個品系(ZB107,ZB306)進行轉錄組測序,比較品系間SNP。分別對兩品系正反雜交種子胚乳的F1(ZB306×ZB107)與F’1(ZB107×ZB306)進行測序,找出親源特有的位點與基因,并進行了表達量分析與甲基化分析。
樣本設計:

總體分析思路

1.胚乳印跡位點

研究方法:
對四個樣本進行轉錄組重測序,將兩個親本進行比較,得到SNP信息。將正交與反交樣本同樣比較得到SNP信息,根據胚乳等位基因表達量的母本/父本的2倍關系,得到親源特異的SNP,并進行了篩選。

所得結果:
雜合子中184個母系偏向表達SNP(178個基因),11個父系偏向表達SNP(9個基因),這些作為潛在的印跡區域。30個位于基因間區,22個為5’與3’UTR延伸,8個為新轉錄本(可能是lncRNA)。
61 (ZB107)與10 (ZB306)基因有大于90%的親本偏向性。

區分不同親源reads的原理

親本特異表達基因分析

1)F1與F’1中基因在母本和父本來源基因的表達情況統計圖。
2)圖中各點代表得到潛在印?;?,紅色代表親本特異表達的基因,藍色代表非特異表達基因;紅線與藍線分別代表2:1與1:1的父/母本表達量比值的對數。

2.印跡位點的確認

研究方法:
將所有的母系偏向的經過篩?。ㄆ蚵食?5%,reads數超過100條)的基因,以及所有的父系偏向的基因找出,并進行了qPCR分析。

所得結果:
1)共57個印?;潁?1(全部58)個基因在母系等位基因中顯著表達,6(全部9)個基因在父系等位基因中顯著表達。這些基因的表達量均由qPCR結果進行了驗證,結果與測序得到的一致。
經過確認,印記基因中大部分能在發育過程中保持最初表達模式,且超過一半不是胚乳特異表達。

3.印?;虻姆擲?/p>

研究方法:
將得到的印?;蚪衏luster分析,以及功能分析,并進行了在各物種(擬南芥、水稻、玉米)的同源性比對。對印?;蚋澆淖有畔⒔辛朔治?。(證據顯示:胚乳基因組中低甲基化區域與轉座子有關。)

所得結果:
1)大部分印?;蚨濟揮芯劾嚳植莢諢蜃檣?,(除去三個位置上有2到3個基因相近),GO分析結果沒有顯著性富集的分類。
2)印?;蛟謚參鎦型蔥越喜?,僅有8個(擬南芥/蓖麻),5個(水稻/蓖麻),12個(玉米/蓖麻)印?;蛟謁疚鎦種杏型椿?。其中,僅有一個基因K domain gene 29765.m000727 (homologous to AT3G08620) 在四個物種中均有同源基因(RNA結合蛋白基因)。
3)轉座子結果顯示:在印?;蚋澆寫罅孔癰患?,明顯與擬南芥的DNA/MuDR以及玉米中的DNA/MuDR不同。

轉座子分類圖

全部雜合后代中,印?;蠐敕怯〖;蚋澆虻淖擁姆擲啾冉?。

4.胚乳甲基化分析

研究方法:
對胚乳及胚樣本進行了甲基化測序(BS、30×),比較了胚與胚乳在基因區5’與3’端向外延伸2kb的區域及基因區的甲基化情況。2)對35DAF胚乳中親本特異性甲基化率進行了分析。

所得結果:
1)印?;蛟諗呷櫓邢嘍耘嘸諄式系?,20個印?;蛟諗呷櫓刑匾斕圖諄?。在母源與父源表達比較方面,基因的印跡性與DNA甲基化相關(P<6.6e-6)。在胚與胚乳比較方面,除去兩個胚乳優先表達基因外,印記基因的表達量與甲基化相關性不大。
2)找出了6個親本特異性甲基化的印?;?,均為母本中低甲基化而在父本中高甲基化,大部分印?;蠣揮諧魷智妝咎匾煨約諄?,說明甲基化可能只是基因印跡現象的部分原因。

胚乳與胚中基因及轉座子甲基化率比較

35 DAF hybrid of ZB107×ZB306,胚(紅色)與胚乳(藍色)的各位置CG甲基化率水平(200bp為一個window),圖中兩段分別表示基因與轉座子前2kb與基因后2kb,虛線代表基因與轉座子的起止。

亮點
1)通過研究鑒別了蓖麻中大量的新印?;?,通過系統分析植物印?;蛟誚痰謀J匭苑⑾至酥參鎘〖;蚓哂瀉芮康奈鎦痔匾煨?。通過基因組的甲基化分析,發現了基因印跡的發生和DNA甲基化密切相關,說明DNA甲基化很可能是印?;蚍⑸鬧饕χ?;
2)利用父母本差異SNP,實現對子代父源、母源等位基因表達和甲基化差異的分析;
3)對重測序、RNA-Seq與甲基化分析三者間進行了貫穿,一起解釋基因印跡現象。

 

 

 

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